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過氧化物酶催化以下反應(yīng)：
2 H2O2 →O2+2H2O
這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類（hemeProteins）。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細(xì)胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。
本實(shí)驗是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冷凍干燥，zui后制得高純度的辣根過氧化物酶。
辣根過氧化物酶分子量在40，000左右，是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)7.2；易溶于水，溶解度為5%(W/V），溶液呈棕紅色，透明；也溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH為7.0（對愈創(chuàng)木酚為氫給體而言）。在室溫下HRP在幾周內(nèi)保持穩(wěn)定，加熱到63℃后15分鐘內(nèi)穩(wěn)定。
辣根過氧化物酶氧化還原電勢很低，pH6.08時，E’0= -0.2070v；pH為7.71時，E’0= -0.5787v。

辣根過氧化物酶的作用機(jī)理可分以下幾步：

*步，形成綠色有活性的酶一底物復(fù)合物Ⅰ：
*步第二步，復(fù)合物Ⅰ轉(zhuǎn)變成紅色有活性的復(fù)合物Ⅱ：
復(fù)合物Ⅰ+AH→復(fù)合物Ⅱ+A
第三步，復(fù)合物Ⅱ被還原，釋放出酶：
第三步AH：表示還原型氫供體。
在一定程度上復(fù)合物Ⅱ可自發(fā)地分解成HRP和產(chǎn)物（P），亦可與過量的過氧化氫形成無活性的復(fù)合物Ⅲ。

辣根過氧化物酶的活力測定方法有多種，主要原理介紹如下：
1、Rz值，提純工作的后幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度。
403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質(zhì)的吸收，結(jié)晶的HRP的Rz值為3.04。測定時的酶濃度為1毫克蛋白/毫升。
2、愈創(chuàng)木酚法：測k4[見反應(yīng)式⑶]。以愈創(chuàng)木酚（鄰甲氧基酚，guaiacol）為氫給體，其反應(yīng)如下：
四鄰甲氧基連酚有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚（E470nm = 26.6mM－1·cm－1）生成的速度（dx/dt）與底物過氧化氫以及氫供體愈創(chuàng)木酚的濃度有關(guān)。方程如下：
e—酶濃度；
α0—氫供體起始濃度；
x0為過氧化氫的起始濃度。
如果測定的條件選擇成k4α0》k1x0，可以測得k1：
所以
所以：

—測定過程中底物減少的速度。
本實(shí)驗是采用測定k4的方法來判斷酶的純度。
上述測定Rz值和k4值的方法雖然比較簡單，但都不能測得酶的實(shí)際活力單位。測定過氧化物酶的傳統(tǒng)方法是連苯三酚試驗法，以過氧化氫為底物，在酶作用下，連苯三酚可形成紅棓酚（Purpurogallin），在430nm處測定產(chǎn)物的形成。用紅棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下1毫克酶所形成的紅棓酚微克數(shù)。

辣根過氧化物酶

儀器和試劑
儀器
離心機(jī)、干燥器、分光光度計。
試劑
⒈ 硫酸銨：工業(yè)純和化學(xué)純；
⒉ 丙酮。
⒊ 10mM pH7.0磷酸鹽緩沖液：稱取243.5毫克磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），溶于400毫升水中。
⒋ 20mM愈創(chuàng)木酚溶液：取0.22毫升愈創(chuàng)木酚加水至100毫升。
⒌ 40mM過氧化氫溶液：取0.4毫升30%過氧化氫加水至100毫升（如測k1則用10mM過氧化氫溶液）。臨用前配制。
⒍ 5%乙酸鋇溶液
⒎ 奈氏試劑
⒏ 0.1 mol/L硝酸銀溶液 

辣根過氧化物酶